コンビネーションスクリーニング法
コンビネーションスクリーニング法とは？
コンビネーションスクリーニング法は、抗体の大腸菌表面提示を利用したスクリーニング法（大腸菌ディスプレイ法）と抗体の大腸菌外分泌を利用したスクリーニング法（抗体ダイレクトクローニング法）を組み合わせた、バイオピーク独自のスクリーニング法です。ウサギ・アルパカ・サメなどへ抗原を免疫した免疫細胞から作製する、scFv・VHH・VNARなどの大規模な大腸菌発現抗体ライブラリから、大腸菌ディスプレイ法により目的抗体発現大腸菌（陽性クローン）を濃縮し、濃縮ライブラから抗体ダイレクトクローニング法により陽性クローンを同定します。コンビネーションスクリーニング法を用いることで、3日間という短期間に大規模なライブラリから陽性クローンを同定し目的抗体を樹立することが可能です。スクリーニング期間が大幅に短縮られたことで、低コストかつ短期間に新規抗体を得られることに加えて、大腸菌の増殖によるバイアスの低減によりユニークな抗体を多数得ることが可能になりました。
大腸菌ディスプレイ法
大腸菌表面に抗体を提示発現するために、scFv・VHH・VNARなどのシングルドメイン抗体は大腸菌外膜タンパク質と融合して発現します。大腸菌表面に提示発現した抗体は、ビオチン化抗原、磁性粒子標識抗ビオチン化抗体と反応し、磁性カラムを使用して選別し、目的抗体を提示する大腸菌クローンが濃縮されます。
抗体ダイレクトクローニング
大腸菌ディスプレイ法により濃縮された大腸菌は、寒天培地、抗原固相化メンブレン、親水フィルタが重層されたフィルターサンドイッチ上に播種し、コロニーを形成します。コロニーに誘導剤と外膜不安定化剤を噴霧することで、大腸菌から抗体と抗体が含まれる外膜小胞（OMV）が生成されます。OMVを利用することで、抗体提示系から抗体分泌系にモード変換することが可能になりました。抗体が含まれるOMVは親水フィルタを通り抜け、メンブレン上の抗原とOMV上の抗体が結合します。この抗原抗体反応を直接検出することで、目的の抗体を確実に同定することが可能です。
特徴
・モードの異なるスクリーニング法の組み合わせによるバイオピークの独自技術
抗体の大腸菌表面提示系から、OMVを利用することで抗体の分泌系へシームレスにスクリーニングのモードを変換する技術を開
発しました。モードの異なるスクリーニングを組み合わせて実施することで、大規模なライブラリから多様性に富んだ抗体を多
数樹立可能です。
・大規模なライブラリから短期間にスクリーニング可能
目的抗体の提示系と分泌系を組み合わせることで、抗体提示系のみのスクリーニングに必須となるパニングの繰り返しが不要に
なりました。大規模なライブラリ(108-9)から大腸菌ディスプレイ法によるパニングを1回実施し濃縮した後、プレートを10枚程
度使用して抗体ダイレクトクローニング法を実施することで、3日間でスクリーニングが終了します。
・低いバイアス
ライブラリ作製の改善により抗体遺伝子の増幅や発現ベクターの構築による抗体配列の偏りが低減しています。さらに、短期間の
スクリーニング系はを増殖や分裂による大腸菌のポピュレーション変化を抑えることで、偏りのない抗体取得を実現しています。
・低い偽陽性率
コンビネーションスクリーニングに抗体分泌系の抗体ダイレクトクローニング法を用いることで、クローンの生産する抗体の抗
体抗原反応を直接検出することから、偽陽性がほとんどありません。抗体の提示系のみのスクリーニングに比べると効率的に多
数の抗体を得ることが可能です。
・多数のユニークな抗体の取得
ライブラリー中の抗体配列の偏りの低減や、大腸菌の増殖やポピュレーション変化を抑えることで、多様性に富んだ抗体を得る
ことが可能です。
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