ラビットscFv抗体
バイオピーク独自の組換え抗体作製技術を用いて、お客様の抗原に結合するウサギscFv組換えモノクローナル抗体を作製する受託サービスです。抗原を免疫したウサギのリンパ組織から抗体ライブラリー（108以上）を構築し、コンビネーションスクリーニング法により、高親和性のラビットscFv抗体を取得します。基本プランの他にスクリーニング方法、取得する陽性クローン数、陽性クローンの評価、抗体発現、抗体改変等のカスタマイズにご対応いたします。入念にお打ち合わせの上、ご要望のプランをご提案いたします。
サービスの特徴
・高親和性の抗体をご提供
マウスの抗体に比べるとCDR2の多様性が高く、免疫細胞数も多いことから、高親和性の抗体を取得することが知られています。
・高安定性抗体の取得
VHH抗体はIgGと比べて高温・界面活性剤・pH・高塩・プロテアーゼ等に対して耐性が高く、
安定性が高いことが知られています。
・多数の陽性クローンを取得
コンビネーションスクリーニング法を利用するため、多数の陽性クローンを得ることが可能です。
・権利フリーの抗体をご提供
納品いたしました抗体可変領域配列の権利は、お客様に帰属いたします。弊社より権利を主張することはございませんの。
特許取得・商用利用などご自由にお使いいただけます。
・構造改変が容易
抗体はscFvの形状でスクリーニングするため、樹立後の抗体への機能付加、構造改変等のAntibody Engineeringが容易です。
ご使用目的
・ 短期間でモノクローナル抗体が欲しい
・ ファージディスプレイ法でscFvのパニングを行なったが上手く行かなかった
・ マウス以外のモノクローナル抗体が欲しい
・ 従来抗体が使えない特殊な条件でもワークする抗体が欲しい
受託サービスの流れ
抗体作製の仕様
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ステップ1 ウサギへの免疫 |
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| 内 容 | 期 間 |
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ウサギ：1～2羽 免疫回数：2週間毎に5回（抗原0.2mg/回） 試採血：初回免疫時、採取免疫1週間前 本採血：最終免疫1週間後 |
9週間 |
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備 考 |
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必要抗原量：・非ビオチン化抗原：免疫・スクリーニング・ELISA用に2.5mg以上 ・ビオチン化抗原：スクリーニング用に0.5mg以上 |
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ステップ2 scFv抗体ライブラリの作製 |
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| 内 容 | 期 間 |
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脾臓の回収 B Cell Panning：脾細胞よりB cellを濃縮 RNA精製：B cellより調整 cDNA合成：B cellより調整したRNA全量をテンプレート使用 |
1～2日 |
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scFv抗体遺伝子増幅：独自に開発したprimerを使用し専用のPCR条件を使用 scFv発現ベクターライブラリ作製：専用のベクターに高効率導入法を用いてVHH抗体遺伝子を挿入 大腸菌ライブラリの作製：発現ベクターライブラリをエレクトロポレーション法により大腸菌を形質転換 （ライブラリは108以上を保証） ライブラリの確認：無作為に選択した複数クローンの配列構造をシーケンシング |
2週間 |
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備 考 |
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・PBMC分離後に抗原を使用したB cell Paninngを実施することにもご対応いたします。 ・作業が終了した時点で進捗をお知らせいたします。 |
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ステップ3 scFv抗体のスクリーニング |
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| 内 容 | 期 間 | ||
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コンビネーション スクリーニング |
大腸菌 ディスプレイ |
scFv抗体を表面提示発現させた大腸菌ライブラリとビオチン化抗原を反応後、マグネットビーズを標識した抗ビオチン抗体をを用いて、陽性クローンを濃縮（104～5倍に陽性クローンを濃縮） |
3日 |
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抗体ダイレクト クローニング |
濃縮した大腸菌ライブラリを、寒天培地・抗原を固相化したメンブレン・コロニーフィルタを重層したプレート10枚に播種し、scFv抗体を発現後、抗原抗体反応を検出し陽性クローンを同定 クローンの回収：48クローン |
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備 考 |
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・コンビネーションスクリーニングの詳細は基盤技術のコンビネーションスクリーニング法をご確認ください。 ・大腸菌ディスプレイはPositive SellectionとNegative Sellctionを実施することや、Sellctionを繰り返すことが可能です。 ・抗体ダイレクトクローニングはPositive Sellectionのみを実施いたします。 ・回収クローン数は48クローン以上にもご対応いたします。 |
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ステップ4 回収クローンのテスト発現とELISA |
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| 内 容 | 期 間 | |
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テスト発現 |
回収した48クローンを10mLの培地でテスト発現しライセートを回収 |
1週間 |
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ELISA |
テスト発現したライセートを用いて、イムノプレートに固相化した抗原に対する陽性クローンのscFv抗体の反応性を評価 中間納品：ライセート(約1mL)とELISA結果の報告書 |
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備 考 |
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ELISAの抗原はご相談いただけます。 |
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ステップ5 ユーザーによる評価 |
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| 内 容 | 期 間 |
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ステップ4のELISA結果とサンプルをご評価いただき、2クローンを選択 選択クローンのご連絡 |
任意 （2週間目安） |
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備 考 |
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2クローン以上にもご対応いたします。 |
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ステップ6 選択クローンの抗体配列解析と納品 |
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| 内 容 | 期 間 |
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選択クローンからプラスミドを精製 プラスミドの抗体可変領域のシーケンス解析 最終納品：抗体可変領域の配列情報 |
1週間 |
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備 考 |
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抗体遺伝子の納品や、抗体の発現は別途ご依頼いただくことも可能です。 リコンビナント抗体発現をご検討いただく場合、抗体エンジニアリングもご相談いただけます。 |
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納品物
1. 中間納品物：48クローン分のライセート及びELISA結果報告書
2. 最終納品物：2クローン分のVHH遺伝子配列情報
*スクリーニングで得られた陽性クローン数が最大クローン数に満たない場合、得られた全ての陽性クローン数を納品いたします。
オプション作業例
| 追加作業の内容 | 期 間 | |
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ステップ1 |
B Cell Pnningの実施 ライブラリ作製前に、ビオチン化抗原を使用して、抗体生産B cellの濃縮を行います。 |
1日 |
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ステップ2 |
scFv抗体のタグ変更 scFv抗体にはHis tagが付加されています。E tagへの変更にご対応いたします。 |
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ステップ3 |
大腸菌ディスプレイ Negative Selectionの実施やPositive Selectionの追加 抗体の特異性や交差性等を選択する高機能な抗体の取得を目的とする場合に実施します。 |
3日～ |
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抗体ダイレクトクローング Plateの追加 より多くのクローンを評価する場合に実施します。 陽性クローンの取得数追加 49以上のクローンをご希望の場合に追加いただけます。 (検出した陽性クローンが48クローンに満たない場合はご利用いただけません。) |
3日～ |
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ステップ4 |
取得クローンの追加 49以上のクローンをご希望の場合に追加いただけます。 抗原の追加 ELISAは通常1種類の抗原で評価いたしますが、2種類以上ご希望の場合でもご対応いたします。 |
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ステップ5 |
選択クローンの追加 ご希望のクローンが3クローン以上となりました場合に追加にご対応いたします。 |
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抗体の樹立後 |
抗体の発現精製 大腸菌や哺乳類細胞（293, CHO）での発現を実施いたします。 |
4週間～ |
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発現ベクターの作製 任意のベクターの抗体遺伝子を挿入し発現ベクターを作製いたします。 |
2週間～ | |
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エピトープマッピング 抗体のエピトープを決定いたします。 |
6週間～ | |
* 上記以外もご相談ください。
抗原のご用意
非標識の可溶性抗原を1mg/mL以上の濃度で2.5mg以上、Biotin化抗原0.5mg以上をお送りください。
（非標識抗原：免疫に1mg、抗体ダイレクトクローニング・ELISAに1.5mg、Biotin化抗原：大腸菌ディスプレイに0.5mg）
注意点
・抗原の溶液はPBSを推奨しております。
・抗原や溶液の毒性や感染性につきましての情報はお知らせください。感染の危険がある抗原
につきましては、受け入れできない場合がございます。
・抗原をお客様にご用意いただけない場合や、十分量を確保できない場合はご相談ください。
・抗原がペプチドや低分子化合物の場合、KLHやBSAのコンジュゲートをお願いいたします。
（免疫用にKLH、スクリーニング用にBSAを推奨しております。）
抗原送付先
株式会社バイオピーク 埼玉事業所
〒345-0041
埼玉県北葛飾郡杉戸町茨島959
TEL:0480-99-1252